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WB条形不好看?这些制胶细节你都注意了么?

生物技术 bionav 1年前 (2021-04-03) 2410次浏览 已收录 0个评论 扫描二维码

嗨咯!大家好,我是忘忧君,第一次跟大家见面,有点紧张,讲的不好的地方欢迎留言探讨。

SDS 凝胶的试剂以及配方在这里我就不多赘述了,大家都了然于胸了,再多讲就是啰嗦,浪费大家的时间。

好了,废话不多说,进入正题,先放上我制备的胶做出来的WB显影图,所谓没图没真相,不能空白(口)无凭。

WB条形不好看?这些制胶细节你都注意了么?

相信大家在实验中或多或少总会出现一些条带不美观的图,比如下面列举的:

 

 

WB条形不好看?这些制胶细节你都注意了么?    图 1 条带紧靠

 

 

 

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图 2 边缘效应

WB条形不好看?这些制胶细节你都注意了么? 图 3 微笑型条带

 

WB条形不好看?这些制胶细节你都注意了么?图 4 漏液

 

图 1 应该是比较容易出现的,原因在于浓缩胶过长(1cm 以上)使蛋白在浓缩胶中迁移的时间比较长,由于其孔径结构比较大,蛋白很容易横向迁移,最后造成条带变宽。

 

图 2 是实验中经常出现的,大家也都知道它(边缘效应)。通常我们常规的做法就是避免使用第一孔和第十孔。但是有时候我们可能有 9 个样品,但是又不想用 15 孔胶怎么办? 其实解决这个问题很简单,只要理解它造成的原因就很容易做出 9 孔都漂亮的条带图。

造成边缘效应很大的原因是电流不均衡,这是仪器本身的构造造成的,不可避免。但是大量的实验中,我们发现,蛋白在凝胶中迁移的距离越短,其条带变形的幅度越少,所以,想要漂亮的 9 孔条带图,可以让目标分子迁移距离变短即可。

 

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图 5 边缘效应

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图 6 短距离跑胶

图 3 和图 1 是孪生兄弟,都是条带宽。但是造成图 3 的情况跟图 1 完全不一样,图 3 并不是浓缩胶过长,而是梳孔本来就宽。原因在于浓缩胶制备好之后,没有及时将胶放入电泳槽中,凝胶因失水收缩,梳孔变宽,且孔两边是凹进去的。在电场的情况下,两边和中间的电流不均衡,中间的电流稍微强一点,条带有点向中间靠,最终造成上宽下窄的情况。

 

图 4 是实验中最不常见的漏液情况(蛋白样品从胶与玻璃间隙流出),其原因不外乎两种,第一,玻璃不干净,有残渣;第二,点样过程中,枪头插入过深,挤开了玻璃,造成蛋白液漏出。相比于这种不常见的,比较常见的另一种漏液(勉强算的上),点样孔上有气泡,蛋白样品渗入气泡中,最后造成条带突出一个小黑包。所以,正常的做法是玻璃不能有残渣剩余,梳子倾斜一定角度插入浓缩胶中,让气泡从一边冒出。

 

问题都分析完了,但是我们怎么做好一块完美的胶呢?

 

根据我 1000 多天的制胶经验,制备完美胶会遇到的两大杀手:温度和 AP。稍微有点实验经验的都知道,SDS 凝胶凝固的速度跟温度有关,温度越高凝胶凝固的速度越快。因此,夏天和冬天是我们必须注意的时间点。

夏天温度高,灌胶速度慢了很可能会在插梳子的时候直接凝固了,因此,要么你手速够快,要么减少 AP 的浓度来降低凝固速度。或者你用 10ml 抢来灌胶(简直是神器)。也可以将 30%的甲叉双丙烯酰胺,水,Tri-Hcl 和 10%SDS 按照比例混合(4℃一个月没问题),使用时取出一定体积,然后加入 AP 和 TEMED 即可。(特别是胶数量多的情况)。

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图 7 大枪灌胶

冬天温度低,凝胶速度过慢,很容易使分离胶缓慢流出玻璃外使分离胶变短,最终造成图 1 的结果。根据经验的积累,一般时间在 30-40min 是比较好的凝固时间,如果超出这个时间,就要检测是否是温度过低还是 AP 效果不佳了。温度低的情况下可以加 2 倍的 AP 来观察凝胶情况,如果 2 倍 AP 都没发让胶在最佳时间段凝固,则需要检测 AP 是否失效了。未失效的 AP 呈颗粒分明的状态,不聚团,如图 8 所示,而失效的 AP,会成块状。若出现成团 AP,则需要更换 AP。

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图 8 正常 AP

 

凝胶凝固时间,温度和 AP 都注意的话,只需要按照正常操作即可。另外,插好梳子等浓缩胶凝固完全之后,记得将胶置于电泳槽中,避免凝胶失水,造成凝胶性质变差。

最后,祝大家学业有成,实验顺利! :oops:


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